NBT/番茄青枯病的噬菌体联合治疗
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题目：《Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato》
《番茄青枯病的噬菌体联合治疗》
期刊：Nature Biotechnology
IF:35.7
通讯作者：沈其荣
摘要
噬菌体已被提出作为农药的替代品来杀灭农作物的致病菌。然而，噬菌体的生物防治效果是可变的，且其在自然根际微生物群落中了解甚少。研究了不同噬菌体组合对番茄感染 R.solanacearum 的生物防治效果。在温室和田间试验中，增加噬菌体组合的数量可使单一作物季节的发病率降低 80%。发病减少的原因是病原菌密度降低，选择了耐噬菌体但生长缓慢的病原菌株，并富集了对 R.solanacearum 有拮抗作用的菌种。噬菌体处理不影响现有的根际菌群。特异性噬菌体组合可能成为控制植物致病菌的精密工具。
实验设计
利用从中国番茄田分离到的 1 - 4 个遗传相似性高，但侵染范围有明显差异的噬菌体类型组成的噬菌体组合
1. 在温室和田间试验中评估噬菌体组合的有效性
温室试验：番茄种子催芽后种到水稻土中（通过实验验证土壤中无病原菌及 噬菌体），7 天后接种菌悬液（每克土壤约 107 个细胞），接种病菌 2 天后分别接种不同噬菌体组合（每克土壤的最终噬菌体颗粒浓度约为 106 粒）。
实验结束时（病原体接种 38 天后），记录发病率，每个处理中随机选两株健康植株收集根际土，每克根际土样品与 9ml 水混合，用于分离噬菌体，2g 随后用于测定病原菌种群密度、提取根际微生物 DNA、噬菌体抗性和抗性成本测试。对照处理仅包括病原体，不添加噬菌体。
大田试验：番茄苗在育苗盘中培育 30 天后移栽到在自然感染病原菌十余年的田间，移栽 7 天后，接种噬菌体(每
株约 109 个形成菌落单位) ，除 4 个独立的单噬菌体和 4 个噬菌体联合处理外(补充表 2)，建立了不含噬菌体的对照处理，记录青枯病严重程度，以此进行生物控制效率进行测定。
2. 噬菌体抗性的定量和进化的 solanacearum 分离株的抗性成本
通过病菌在液体培养基中的生长抑制作用来确定噬菌体的抗性。采用模型根渗出液培养基培养菌株， 在 24 小时内， 每隔 4h 细菌密度相对于原先菌株降低最大值被量化为抗性成本。
3. 采用直接共培养竞争试验，测定了进化后的耐噬菌体病原体菌株与敏感的原始病原体菌株之间的竞争能力。
4 用培养相关和独立的方法测试三种噬菌体组合对细菌群落组成和多样性的直接影响。
使用一种与培养无关的方法，直接检测在没有病原体的情况下，三种 噬菌体 组合的存在是否直接影响了天然根际微生物群落的组成和多样性：创建 1:9 的水稻土壤-无菌水混合物，单独或同时接种三种噬菌体或三种噬菌体组合， 振荡培养 48h 后，提取 DNA 测序。
用一种依赖培养的方法测试了非致病性细菌分离株对感染病原菌的噬菌体的敏感性，从相同的水稻土壤中随机 分离出可培养的细菌，对其 16S rRNA 基因进行测序鉴定，用条带法检测非致病性菌株对噬菌体的敏感性
5.非致病菌分离株对病原菌抑菌作用的测定。
比较了在成对培养条件下与非致病菌共同培养和单独培养时病原体密度，研究可培养的非致病菌分离株是否对病原 体产生负面影响(通过干扰或资源竞争）
结果与讨论
1. 噬菌体对温室和田间病害发生的影响
图 1 噬菌体的组合和发病率。a,b，在温室试验结束时，噬菌体组合对疾病发生率(a)、病原体和噬菌体密度(b)的影响(单噬菌体和三噬菌体处理 n= 12， 两噬菌体处理n= 18)。c，田间试验结束时，单噬菌体和四噬菌体处理对植物病害严重程度(病害指数)的影响(n= 48;x 轴上的缩写表示四种不同的噬菌体类型)。
与对照相比，单一种类的噬菌体降低了青枯病的发病率(图 1a)，但含有较多噬菌体的噬菌体组合降低了病害的
发病率(图 1a)。疾病发生率的降低可以用病原体密度的降低来解释，这种效应随着组合中噬菌体数量的增加而增强(图 1b)。在现场实验中，我们观察到类似的结果。田间试验中，四种噬菌体均有较好的生物防治效果(图 1c)，使青枯病严重程度(疾病指数)较对照平均降低 80% (图 1c)。然而，我们的四种噬菌体组合具有最高的生物防治效果(图 1c)。综上所述，这些结果表明，虽然所有噬菌体类型都能有效降低青枯病的发病率，但它们在温室和田间条件下组合使用时更有效。
1. 温室试验中噬菌体抗性的演变
图 2 .对祖先噬菌体和共同进化噬菌体的抗性进化。噬菌体的祖先(a, b)和阻力共同进化(b)噬菌体和在没有噬菌体的情况下，培养 24 小时后的病原体携带能力方面的抗性成本(c), d 病原菌携带能力与噬菌体抗性呈负相关关系，说明了抗性-生长平衡。红色虚线表示在没有噬菌体的情况下病原体进化的对照病原体选择株系的抗性(a;n= 3)和没有噬菌体的祖先病原体株的生长(c;(n= 3). (对照组n= 3，单噬菌体和三噬菌体处理n= 12，两噬菌体处理n= 18;从每个样品中分离出 8 个克隆体)。
补充图 7 温室试验结束时病原菌竞争力与噬菌体联合处理的关系
结果表明，在三种噬菌体组合的作用下，病原菌对噬菌体的抗性范围最广(图 2a 图 2b)。进化出对噬菌体的抗性代价高昂，在没有噬菌体的情况下，病原体的生长力下降(承载能力，图 2c，最大生长速度，补充图 6)。此外， 当病原菌暴露于多种噬菌体时，这一成本的大小增加，导致噬菌体抗性与生长之间的负相关性更大(携带能力，图2d)。在与噬菌体敏感的祖先病原体基因型的竞争力测试实验中，这种增长的成本也与耐性病原体竞争力下降有关(补充图 7)综上所述，这些结果表明噬菌体组合可以选择耐药但生长缓慢的病原体，从而降低疾病的发病率。
3.噬菌体对根际微生物群的影响
图 3 噬菌体对根际群落的|影响。不同噬菌体组合处理下根际细菌群落组成(a)和多样性(b)的变化(组成和多样性分析分别基于 NMDS 分析和基于OTUs 的Shannon 多样性指数)。c、不同噬菌体组合处理中病原菌(黑色)和其他菌门(其他颜色)的相对密度变化d，潜在的驱动类群对观察到的单噬菌体和三噬菌体组合之间的细菌共生网络的变化很重要
补充图 10 噬菌体对细菌共生网络的影响在温室试验结束时，单噬菌体和三种噬菌体组合处理的细菌共生网络。每个节点代表一个细菌 OTU，每个边代表一个与负相关(蓝色)和正相关(红色)的Spearman 相关。节点颜色代表了在门水平上的分类
噬菌体的存在对根际微生物群落的组成有很大的影响(图 3a)。具体来说，增加噬菌体组合中的噬菌体数量与细菌群落多样性高度相关(图 3b)也与一些细菌门类相对丰度相关(图 3c ). 单噬菌体网络连接更紧密，路径长度更短， 这表明它们之间的相互作用可能更频繁(补充图 10 和补充表 4)。单株噬菌体与三株噬菌体群落的类群结构基本不同， 大多数类群的结合体是完全不同的，随着噬菌体数量的增加，显著的结合体数量而增加(图 3d 分别为 72 个和 230 个结合体)。此外，Netshift 分析发现 40 个潜在的驱动分类单元与微生物组组成的变化有关(图 3d)。
图 4 |噬菌体的特异性及其对根际微生物群的抑制作用。a,b，在没有病原体和三种噬菌体组合的情况下，天然细菌群落的组成(a)和多样性(b)的变化。c， 基于 400 个可培养分离株的系统发育树和 cladogram 中不同节点颜色表示四种不同的门:变形杆菌门(44.00%;红色)、厚壁菌门(23.25%;蓝色)、拟杆菌(20.25%;紫色)和放线菌(12.50%;绿色);不同的环色是在不同的分类学水平上观察到的细菌OTUs。d,抑制祖先 r . solanacearum 病原体的菌株 5 个属,是富含越来越多的噬菌体。d、蓝色、灰色和橙色虚线分别表示，随着噬菌体组合中噬菌体数量的增加，细菌分离株数量减少，但与噬菌体数量无关或大量增加，这些细菌分离株对祖先病原体的抑制能力平均。所有这些都是基于生物独立的样本。
这些结果表明，噬菌体只能侵染病原菌，而根际微生物群落组成、多样性和物种共生网络的变化是由间接反馈
驱动的(图 4a;图 4b)。我们在实验室中使用病原体和所有 400 个分离的非致病性根际细菌进行了成对竞争共培养实验,一些细菌可能通过资源或干扰竞争的方式对 病原菌 产生抑制作用（图 4d）。
4.噬菌体生物防治的生态学和进化特征。
图 5 噬菌体介导青枯病的|机制。图中显示的是一个结构方程模型路径图，揭示了噬菌体介导的疾病发病率影响背后的生态和进化机制。红色、蓝色和灰色箭头分别表示阳性、阴性和非显著途径，箭头旁边的数字表示这些影响的程度。圈内数字显示的比例方差解释其他变量和χ2，NFI 值表示模型的拟合度
通过偏最小二乘结构方程模型分析(PLSSEM)和路径模型估计(pathway -modeling estimation)，揭示了温室中噬菌体生物防治成功背后的生态和进化机制的相对重要性。(图 5)。
结论
本研究以噬菌体来靶向针对病原菌，从噬菌体对病原菌的两类抑制机制入手，采取噬菌体联合治疗的方式，一方面可以显著减少病原菌密度及发病率，另一方面使得病原菌抗性进化成本加大，影响其数量增长、竞争力及侵染植物的能力。此外还考虑了针对此病原菌的噬菌体对本土根际微生物的影响，证明其无害性；聚焦于被富集的细菌类群及其与病原菌的成对竞争共培养实验。最后构建了噬菌体通过降低病菌密度和进化权衡进行生物的防治模型。证明了噬菌体可以作为一种精确的工具来改善温室和田间的植物健康。为有关噬菌体在防治植物病害方面提供了有效性的实验证据。
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